До середины XII в. Брестская (летоп. Берестейская) земля входила в состав Туровского княжества, где уже в 1005 г. была православная епархия. При волынском князе Мстиславе Изяславиче (1156–1170) Владимиро-Волынская епархия пополнилась Берестейской волостью, отделенной от Киева, а в церковном отношении, видимо, от Турова. Поэтому с середины XII в. православные христиане Берестейщины окормлялись Владимиро-Волынскими епископами. Появление в XIII в. первых православных каменных храмов на Берестейской земле – в честь апостола Петра в Берестье (ныне Брест) и в честь Благовещения Пресвятой Богородицы в Каменце – связано с деятельностью Владимиро-Волынского князя Владимира Васильковича. С кон. XIV в. – нач. ХV в. (1391 г. или 1405 г.) епархия получила название «Владимирская и Берестейская», а епископы именовались «Владимирскими и Берестейскими». В 1405 г. митрополит Киприан (Цамблак), находясь на Волыни, поставил Иоанна (Гоголя) епископом Владимирским и Берестейским.
Берестье являлось центром одной из протопопий епархии, вторая кафедра которой находилась в Свято-Никольском храме древнего города (территория современной Брестской крепости, монумент «Жажда»). Главой православного духовенства в Берестейской части епархии был «протопоп Подляшский», стоявший во главе берестейского клироса (клирос – собрание духовенства кафедрального собора, помогавшее архиерею в управлении епархией). При Никольском храме также располагалась резиденция епископов (по документам «Брестская русская кафедра»). Здесь в 1590, 1591, 1594 гг. проходили Берестейские соборы западно-русских епископов, целью которых было укрепление церковной дисциплины и создание условий для просвещения паствы и ее воспитания в православном духе. После издания в 1591 г. королевской грамоты, разрешавшей берестейским православным мещанам иметь братства со школами, при храме было основано Николаевское Братство. В 1593 г. епископ Владимирский и Брестский Ипатий Потей утвердил основание Братства.