В 1596 г. в Никольском храме была заключена печально известная Брестская церковная уния, среди главных организаторов которой был отступник от Святого Православия, епископ Владимирский и Берестейский Ипатий Патей. После заключения церковной унии Владимро-Бререстейская епархия стала униатской, а подавляющее большинство приходов и монастырей было подчинено Литовско-Новоградской униатской митрополии.
С 1616 г. прилагались усилия по восстановлению православной Владимиро-Брестской епархии. Самая известная попытка осуществить задуманное была предпринята после приезда на украинские земли в 1620 г. Иерусалимского Патриарха Феофана IV. В январе 1621 г. на кафедру был поставлен представитель волынского княжеского рода архимандрит Трехтемирова монастыря Иосиф (Курцевич). Хотя 15 марта 1621 г. великий князь литовский и король польский Сигизмунд Ваза предписал не допускать епископа Иосифа в епархию, но он тайно прибыл на Волынь и активно выступил в защиту Православия. Спасаясь от преследования властей и униатов, епископ был вынужден летом 1625 г. уехать в Московское государство, после чего Владимиро-Брестская епархия присоединилась к Луцкой епархии.
Хотя после заключения унии подавляющее большинство бывших православных приходов и монастырей Берестейщины изначально подчинились униатской Киевской митрополии, но с 1630-х гг. усилилось сопротивление унии и многие отпавшие стали возвращаться в Православие. Очагами борьбы за правую веру были Брестские Православные Братства – Николаевское и Рождество-Богородицкое, стойким защитником Православия был преподобномученик Афанасий (Филиппович), игумен Брестского Свято-Симеоновского монастыря. Немногочисленные существовавшие на Брестской земле православные приходы, после заключения унии, окормлялись в разное время епископами: Луцкой, Киевской митрополичьей, Белорусской (Могилевской), Минской епархий. К 1787 г. в Православии оставались Брестский мужской монастырь преподобного Симеона Столпника (с 1798 г. здесь была учреждена архимандрия) и 4 монастыря на Подляшье.